Суспензию изолированных клеток контролировали под микроскопом. Соответствующие концентрации клеток затем быстро смешивали средой 5А, содержащей 15 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), при 45 °С, после чего ДК заполняли необходимым числом клеток, суспендированных в смеси среды, сыворотки жидкость собирали в пробирки, куда добавляли 100 ед/мл гепарина. После центрифугирования в течение 10 мин Клетки дважды отмывали средой RPMI-1640, содержащей ЭТС с добавлением гепарина. Число жизнеспособных клеток Подсчитывали в камере Горяева с помощью красителя трипанового синего. Клеточную суспензию, содержащую 105 — 8 x 105 клеток/мл среды 5А, включающую ЭТС и агар, разливали по 0,18 мл в миллнпоровые ДК с. После застывания агара, отверстие ДК заклеивали и ДК имплантировали (но 2 камеры) в брюшную полость облученным при дозе поглощения 7 Гр мышам СВА; за 48 ч до облучения мышам внутри вводили 200 мг/кг Такая защитная комбинация: ЦА + облучение — делала необязательной повторную, через 9 сут, трансплантацию ДК новым реципиентам и позволяла инкубировать клетки опухолей в течение 21 сут. Колонии определялись как агрегаты, содержащие более 40 клеток, кластеры — от 8 до 40 клеток. На каждую концентрацию клеток использовано от 4 до 8 ДК. Для морфологического анализа колонии фиксировали 3 %-ным глютаровым альдегидом с последующей окраской по Гизе. Наиболее устойчивый рост, при котором не нарушалась линейная зависимость роста от концентрации клеток, наблюдался при изучении асцитного рака яичника. Удвоение клеток обычно наблюдалось уже в течение 48 ч после посева. Кластеры с числом клеток от 8 до 40 появлялись, начиная с 5 — 7 сут. Единичные колонии появлялись через 7 сут. В последующие сроки их число увеличивалось и достигало максимума к 21-ым сут, после чего отмечено некоторое снижение их числа. Клеточный лизис отмечен через 28 сут. В течение первых 2 недель инкубации наблюдалось прогрессирующее увеличение числа клеток в колониях. Число колоний в каждой ДК варьировало от нескольких колонии до более чем 40 колоний на ДК; колонии содержали от 40 до более чем 100 округлых клеток, т. е. размер колоний, как видно, также сильно варьировал. Клетки в колониях, особенно в больших, были плотно упакованы. Колонии содержали мелкие округлые, и более крупные клетки. Многие клетки были вакуолизированы
адаптація и рост в культуре
По периферии колоний не отмечался слой свободно лежащих клеток, характерный для макрофагальных колоний. Наблюдались индивидуальные различия по форме и упаковке клеток в клеточных колониях опухолей яичников, что, вероятно, обусловлено различиями между стволовыми клетками в пределах одной популяции. Морфология колоний не зависела от гистологического типа опухоли. Средняя эффективность клонирования составляла для асцитного рака яичника 0,01 %, злокачественной глиомы — 0,03 %, мелко клеточного рака легкого — 0,2 %. Получена линейная зависимость между числом посеянных в ДК клеток и числом колоний, образовавшихся через 21 сут для концентраций 3,6 — 14,4 x 104 клеток/ДК; коэффициент корреляции составлял 0,986 с ошибкой 1 % Хорошо известно, что определение числа клоногенных клеток и изучение лекарственной чувствительности возможно только после установления клеточных доз, в интервале которых существует линейная зависимость между числом введенных клеток и числом образующихся колоний.
Таким образом, полученные данные показывают, что клетки опухолей человека можно клонировать без предварительной их адаптации к росту в культуре, а результат действия противоопухолевых препаратов на образование колоний в такой системе может быть использован для индивидуальной химиотерапии больных с различными опухолями, включая рак яичника. Однако корреляция, по-видимому, не всегда может быть прямой и вряд ли можно было бы ожидать, что измерение одного параметра, даже такого важного, как клопогонная способность, будет отражать полностью ситуацию в опухоли. Эта информация представляется важной, так как в настоящее время она не может быть получена с помощью других методов. Необходимо в то ; же время помнить и об ограничениях. Для клеток, взятых из первичных опухолей, низкая эффективность клонирования является наиболее важным ограничением. Возможно, что па способность клетки выполнять функцию стволовой клетки оказывают влияние клеточные контакты с неопухолевыми клеточными элементами.