Замораживание клеток

Перед гибридизацией спленоциты и клетки миеломы центрифугировали в градиенте плотности фиколла в целях удаления мертвых клеток и эритроцитов. Суспензию клеток после гибридизации разливали на пять 96-луночных пластинок, на фидерный слой макрофагов. Клетки культивировали в среде KPMI с добавлением 10 — 15 % стальной сыворотки. Удаление родительских миеломных клеток происходило в среде ИАТ, приготовленной на ростовой среде. Клетки культивировали в среде HAT с момента гибридизации в течение 2 недель. Супернатанты тестировали на живых клетках реакцией непрямой иммунофлюоресценции. В качестве мишеней использовали клетки К-2, клетки печени эмбрионов здоровых мышей (на 14 — 18-й день внутриутробного развития) и селезеночные клетки мышей, зараженных вирусом лейкоза Раушера. Меченные ФИТЦ антитела кролика против иммуноглобулинов крысы (производство Института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АН СССР) были предварительно истощены нормальной мышиной сывороткой и клетками К-2. Реакцию иммунофлюоресценции (РИФ) проводили на предметных стеклах, покрытых полилизином (0,1 мг/мл). Гибридомные клетки замораживали и хранили в жидком азоте при — 190 °С. Реклонирование гибридомиых клопов производили методом конечных разведений, концентрация клеток составляла 1 клетку на лунку. Тестирование основной массы супер Натанов проводили на 10 — 13-й день после гибридизации. К этому времени в каждой лунке находилось 3 — 6 гибридомных клонов. Первоначально были отобраны и заморожены в жидком азоте 137 гибридомных клонов, супернатанты которых реагировали с суспензиями клеток мишеней. Для дальнейшего анализа были выбраны 2 гибридомных клона — МАЕ15 и МАЕ50, отличавшиеся после 2 реклонировапий сильной и стабильной секрецией моноклональпых антител.
Клетки К-2, эритробласты и ретикулоциты эмбриональной печени и селезенок мышей с эритролейкозом Раушера реагировали на моноклинальные антитела МАЕ15 и МАЕ50 специфическим свечением. В клетках гранулоцитарно макрофагального и мегакариоцитарного ростков, а также в некроветворных клетках РИФ не наблюдалась. Моноклинальные антитела МАЕ15 и МАЕ50 не вызывали РИФ на живых клетках пенсии эмбрионов человека (10 — 12 недель развития) и крысы (14 — 18 дней развития). По предварительным данным, МАЕ15 и МАЕ50 являются антителами класса IgG.

Читайте также:  Содержание белков у здоровых людей